GENETISCHE REPARATIES –>DNA schade herstel


 zie onder GENETICA     

°Deze pagina  gaat  over  reparaties aan genetische breuken en  herstel  van  mutaties

http://nl.wikipedia.org/wiki/DNA-schade

°

1)  GEBROKEN CHROMOSOMEN

chromosomen chromatiden  <— DOC Archief

Het nucleosoom – de bouwstenen van chromosomen

http://dier-en-natuur.infonu.nl/biologie/18541-het-nucleosoom-de-bouwstenen-van-chromosomen.html

Velen hebben al gehoord van desoxyribonucleotidezuur, beter gekend als DNA en waarschijnlijk nog meer mensen hebben al van chromosomen gehoord. Minder mensen weten wat de link is tussen beiden, maar nog minder mensen weten ook effectief hoe deze link tot stand komt. Histonen zullen DNA rondt zich wikkelen en aanleiding geven tot een nucleosoom. Dit artikel geeft een basisuitleg over de opbouw van deze zogenaamde nucleosomen en hoe DNA via deze opgevouwd wordt tot een chromosoom.

Molecular Biology of the Gene, 5th edition; Watson, Baker, Bell, Gann, Levine, Losick. ISBN: 0-321-22368-3

°

Bij breuk geen deling

Enzymen hebben 1-uursservice om gebroken DNA te repareren

  • vrijdag 16 januari 2004      Wim Köhler
De cel herstelt DNA-schade ogenblikkelijk. Onder de microscoop zijn de moleculaire details van de herstelwerkzaamheden te volgen. 
Een breuk in een chromosoom is levensbedreigend. Allereerst voor de cel waar het chromosoom in zit, want een cel met een ongerepareerde breuk dwingt zichzelf om te sterven, via het proces van de geprogrammeerde celdood (apoptose). In alle levende cellen circuleren enzymen die chromosoombreuken herstellen, en de meeste van de miljoenen chromosomen die dagelijks in een mens breken worden hersteld. Maar een verkeerd geheelde chromosoombreuk kan kanker veroorzaken, meestal leukemie. Eén chromosoombreuk kan dus de voortijdige dood van een heel organisme veroorzaken. Zorgvuldige reparatie van gebroken chromosomen is dus van levensbelang. Reparatie-enzymen die gebroken chromosomen lijmen zijn dan ook al meer dan twee miljard jaar geleden in de evolutie ontstaan. Over de manier waarop cellen chromosoombreuken helen is de laatste jaren veel bekend geworden.
De groep van Roland Kanaar, verbonden aan de afdelingen genetica en radiotherapie van het Erasmus Medisch Centrum in Rotterdam, samen met moleculaire microscopisten van het Academisch Medisch Centrum in Amsterdam in Science lieten zien dat herstel van gebroken chromosomen ongeveer een uur duurt. De brokstukken worden naar elkaar toe gesleept, waarna herstelenzymen de schade repareren. Kanaar: ,,
Vergeleken met andere enzymatische processen die in seconden kunnen verlopen lijkt de dubbelstrengsreparatie een langdurig proces. Maar bekijk je het op het niveau van de celdeling, dan is een uur niet lang. Een celdeling duurt een dag. De cel moet er echt in slagen om losse stukken weer aan elkaar te zetten. Zolang de breuken niet zijn hersteld, staat de celdeling stil.” De Amsterdamse microscopisten Jacob Aten en Jan Stap bedachten de detectietechniek, waarbij een radioactief alfadeeltje (een heliumkern) door een celkern wordt geschoten, loodrecht op het vlak van de kijkrichting van de microscoop. Zo’n alfadeeltje laat een recht pad van brokstukken achter. De belangrijkste schade bij een chromosoombreuk is het in twee stukken uiteenvallen van het lange DNA-molecuul met erfelijke informatie dat deel uitmaakt van ieder chromosoom. Een DNA-breuk kan betekenen dat er een gen verloren gaat of dat de controle over een gen wegvalt. Dat laatste is de reden van het ontstaan van sommige kankers, waaronder leukemieën. De reparatie-enzymen richten zich allereerst op het aan elkaar lijmen van DNA-brokstukken.Met fluorescerende eiwitten die specifiek aan de breukvlakken binden is het spoor van gebroken DNA onder de microscoop te herkennen. Na een kwartier beginnen de brokstukken te clusteren en na een uur zijn er nog een paar gebieden waar alle breuken zijn samengetrokken.In ieder van de celkernen van de miljarden cellen waar de mens uit bestaat breekt dagelijks duizenden keren een DNA-streng. Een DNA-molecuul bestaat uit twee in elkaar gewonden strengen met complementaire erfelijke informatie. En meestal breekt maar één van beide strengen. Die schade is snel te herstellen. Bij een enkelstrengsbreuk heeft een reparatie-enzym altijd de complementaire streng als matrijs tot zijn beschikking, om het DNA foutloos in dubbelstrengstoestand te herstellen.Een dubbelstrengsbreuk is moeilijker te herstellen. Dubbelstrengsbreuken zijn wat zeldzamer. Ze treden vooral op tijdens een celdeling en bij bestraling tegen kanker. Bij iedere celdeling van een beenmergcel, waar witte en rode bloedcellen en bloedplaatjes uit ontstaan, breekt naar schatting 200 keer een DNA-dubbelstreng. In het menselijk beenmerg delen die beenmergcellen miljoenen keren per dag.Vrijwel onmiddellijk na een dubbelstrengsbreuk verschijnen er bij het breukvlak eiwitten die de schade beperkt proberen te houden. Mre11, een bolvormig eiwitcomplex met twee lange armpjes, bindt met zijn bolle kant aan het DNA en plakt met zijn armen aan de tentakels van later arriverende Mre11’s. In het netwerk dat zo ontstaat raken de beide losse DNA-uiteinden meestal verknoopt. Mre11 is de snelle pleister die verhindert dat de brokstukken uit elkaar drijven. De eerste hulp bij DNA-breuken van Mre11 was ook een ontdekking van Kanaars groep.
Kanaar is een-na-laatste auteur van die publicatie.
Laatste auteur is zijn Amerikaanse echtgenote Claire Wyman die ook in Rotterdam werkt en is gespecialiseerd in het zichtbaar maken van macromoleculen met de scanning force microscope.
Kanaar: ,,De tientallen verschillende enzymen die bij de reparatie betrokken zijn zwerven steeds rond in de celkern, of zijn daar aan het DNA gebonden. Ze binden net iets beter aan het oppervlak van DNA-breuken dan aan andere moleculen. Daardoor ontstaat er na een breuk opeenhoping van de reparatie-eiwitten aan de gebroken uiteinden.” Alle eencelligen met een celkern (eukaryoten) en alle meercellige dieren hebben reparatie-enzymen voor dubbelstrengsbreuken. Er bestaan twee verschillende mechanismen van dubbelstrengsreparatie: niet-homologe eindverbinding en homologe recombinatie .Bij niet-homologe eindverbinding lassen enzymen twee DNA-uiteinden die ze vinden domweg tegen elkaar, zonder te controleren of ze de goede brokken lijmen. In hun ijver kunnen die enzymen de verkeerde brokken aan elkaar zetten. Zo ontstaat een translocatie : een mengvorm van twee chromosomen.
Enkele aangeboren afwijkingen en veel vormen van leukemie en andere tumoren ontstaan als gevolg van dat soort translocaties. ,,Maar de meeste zijn onschuldig,” zegt Kanaar. ,,In `oude’ lichaamscellen vind je honderden mutaties, soms ontstaan door verkeerd aan elkaar geplakte dubbelstrengsbreuken. Meestal geeft dat niets.” Tijdens homologe recombinatie checken de reparatie-enzymen wel of ze bij elkaar horende uiteinden lijmen. Dat doen ze door in de cel het overeenkomstige chromosoom op te zoeken. Alle lichaamscellen (behalve de geslachtscellen) hebben een dubbel stel chromosomen, het ene chromosoom is afkomstig van de vader, het ander van de moeder. Bij de homologe recombinatie leggen de reparatie-enzymen de brokken langs het overeenkomstige gebied van het intacte chromosoom, om te controleren of alles past. ,,Vergelijk het maar met het maken van een legpuzzel,’‘ zegt Kanaar. ,,Meestal gebruik je het deksel van de doos als voorbeeld. Je vergelijkt de afbeelding op een puzzelstukje met het plaatje op de doos. Aan de hand daarvan leg de stukjes in elkaar. Dat is de homologe recombinatie. Heb je geen voorbeeld bij de hand, dan ga je gewoon proberen tot een stukje past. Desnoods dwing je de stukjes om te passen. Dat is de niet-homologe eindverbinding.” Begin jaren negentig waren DNA-reparatie-onderzoekers ervan overtuigd dat lichaamscellen van zoogdieren hun DNA-dubbelstrengsbreuken alleen met niet-homologe eindverbinding repareren en dat eencelligen, zoals gisten, hun dubbele DNA-breuken met homologe mechanismen herstellen. Maar de onderzoeksgroep van Kanaar toonde in 1997 aan dat in zoogdiercellen ook homologe recombinatie plaatsvindt. . Kanaars groep volgt de nieuwe aanpak in de biochemie: veel verschillende technieken gebruiken om de werking van individuele macromoleculen zichtbaar te maken.
,,Uiteindelijk wil je een filmpje dat laat zien hoe een DNA-breuk wordt gerepareerd.” Om dat te bereiken werkt Kanaar ook steeds vaker samen met natuurkundigen.Zij hebben de laatste jaren allerlei technieken ontwikkeld om één molecuul waar te nemen. Kanaar en Wyman hebben bijvoorbeeld al gezamenlijk gepubliceerd met de nanotechnologiegroep van Cees Dekker van de TU Delft.
De nanotechnologen bepaalden sterkte, flexibiliteit en andere eigenschappen van de kleverige armpjes van de eiwitten in het Mre11-complex en rapporteerden in juni van vorig jaar in de Proceedings of the National Academy of Sciences.Kanaar:
,,Met die technieken scoor je uiteindelijk alleen als je naar een biologisch belangrijk mechanisme kijkt. Die context bieden wij. Onze publicatie van vorige week accepteerdeScience vooral omdat we ook inzicht verschaften in de medische consequenties van DNA-breuken.” 
© NRC Handelsblad
°

2007

https://www.lumc.nl/0000/13043/17787/17836/17839/80118022519441

The role of homologous recombination in mitotic and meiotic double-strand break repair

Mw. F.A.T. de Vries

Een gemiddelde lichaamscel krijgt op een normale dag zo’n tienduizend DNA-beschadigingen te verwerken. Een van de meest ingrijpende daarvan is de dubbelstrengs DNA-breuk. Deze vorm van DNA-schade wordt onder andere veroorzaakt door röntgen en radioactieve straling. Femke de Vries onderzocht hoe de hersteleiwitten deze schade repareren. Het bleek dat de drie eiwitten die hierbij betrokken zijn gezamenlijk aanwezig moeten zijn om dit herstel mogelijk te maken. Ook bleek dat deze eiwitten in de cel gemarkeerd worden door een ander eiwit, SUMO genaamd. Wat de functie is van deze marker is nog niet bekend.

SAMENVATTING

DNA, in kranten vaak de blauwdruk van het leven genoemd, wordt continu van buitenaf bedreigd. Gelukkig beschikken cellen over een uitgebreid pakket aan noodmaatregelen om het genetische materiaal intact te houden. Gaat het in enkele gevallen toch fout, dan kan dat leiden tot kanker. Dit proefschrift gaat over één van die onmisbare maatregelen, waarmee de cel haar DNA beschermt. Om deze samenvatting te kunnen begrijpen, zal ik eerst een globale uitleg moeten geven over wat die allerbelangrijkste bouwsteen van levende wezens: het DNA, is.

Elke vorm van leven op aarde is opgebouwd uit één of meer cellen. De kleinste organismen bestaan uit slechts één cel, terwijl grotere organismen uit enkele tot honderd biljoen (een 1 met 14 nullen) cellen zijn opgebouwd. In alle cellen van levende wezens zit DNA, dat niet los in de celvloeistof ligt, maar stevig verpakt is binnen de membranen van de celkern. Niet al te lang geleden, in 1944, bewees Oswald T. Avery dat in het DNA, in codevorm, de erfelijke aanleg van organismen wordt beschreven.

De celkern ligt vol met DNA. Ieder soort organisme heeft een verschillend aantal DNA- moleculen per celkern. Die afzonderlijke DNA-moleculen worden chromosomen genoemd. Zo hebben mensen in elke celkern 46 chromosomen, die samen alle erfelijke eigenschappen van een mens dragen. Die chromosomen zijn veelal verschillend van grootte, maar toch steeds twee aan twee gelijk. De gelijke chromosomen vormen een paar. Menselijke cellen hebben dus 23 paar chromosomen in elke celkern. De informatie op de chromosomen is in elke cel gelijk. Om te zorgen dat deze informatie steeds goed wordt doorgegeven als een cel zich deelt, worden alle chromosomen voor de deling exact gekopieerd. Bij de normale celdeling (mitose) worden de verdubbelde chromosomen vervolgens simpelweg verdeeld over twee nieuwe cellen. Iedere nieuwe cel krijgt op deze manier de volledige set erfelijke eigenschappen mee. Bij de bijzondere celdeling die voorafgaat aan de vorming van voortplantingscellen (meiose), wordt het DNA ook eerst verdubbeld maar daarna in twee stappen (meiose I en II) verdeeld over uiteindelijk vier voortplantingscellen. Elke op deze manier gevormde geslachtscel bevat zo de helft van het aantal chromosomen, slechts één chromosoom van elk paar. Wanneer nu bij de bevruchting twee geslachtscellen versmelten, komen de chromosomen in het nieuw gevormde leven weer in paren voor: één chromosoom van elk paar is afkomstig van vader, één van moeder.

Kleinere stukjes van een chromosoom, de genen, bepalen telkens één van de erfelijke eigenschappen. In 2001 is aangetoond dat een mens 20.000 tot 25.000 verschillende genen heeft. Uiterlijke kenmerken van organismen worden bijvoorbeeld voor een belangrijk deel door erfelijke eigenschappen bepaald; hierbij kun je denken aan de oogkleur van mensen. Soms wordt een eigenschap door één enkel gen bepaald, maar veel vaker zijn er bij eigenschappen meer genen betrokken. Elk gen geeft de instructie voor de bouw van één bepaald eiwit met een eigen specifieke functie. Eiwitten kunnen betrokken zijn bij de opbouw van cellen, maar ze kunnen ook een veel belangrijkere taak hebben, namelijk het uitvoeren van alle levensfuncties. Deze laatste groep eiwitten, de werklieden van de cel die alle reacties in goede banen leiden, heten enzymen.

Als we chromosomen wat verder uitvergroten, dan zien we zeer lange ketens DNA. In 1953 waren de chemische componenten van het DNA bekend. James Watson en Francis Crick deden toen een voorstel voor de structuur van het DNA, zonder dat zij DNA ooit hadden kunnen zien. Later bleek het door Watson en Crick beschreven model juist te zijn. DNA lijkt op een wenteltrap en bestaat uit twee in elkaar gedraaide moleculen waarvan de ruggengraat gevormd wordt door een keten van afwisselend suiker en fosfaat groepen. De verbinding tussen de twee spiraalvormige ketens wordt gevormd door de vier verschillende basen van het DNA: A (adenine), C (cytosine), G (guanine) en T (thymine). C hecht altijd aan G in de tegenoverliggende keten en A hecht aan T in de tegenoverliggende keten. Zo vinden we op het DNA een lange reeks basenparen G-C, A-T, C-G en T-A, in een wisselende volgorde die uniek is voor ieder individu. De code in het DNA, geschreven in een vier-letterig alfabet, wordt gebruikt als recept om eiwitten op te bouwen en biedt de mogelijkheid om de erfelijke eigenschappen van een individu vast te leggen.

Er kunnen spontaan veranderingen (mutaties) in het erfelijk materiaal ontstaan. We spreken van mutaties op het moment dat één of meer letters in het molecuul anders is/zijn (bijvoorbeeld een A wordt een C), of als letters zijn weggevallen (een TCAG wordt een TAG) of toegevoegd. Mutaties zijn vaak handig, ze zorgen voor variatie in erfelijke eigenschappen en maken evolutie mogelijk. Soms heeft een mutatie ernstige gevolgen: als de DNA-code van een gen beschadigd wordt, kan een bepaald eiwit of enzym niet meer of nog maar gedeeltelijk functioneren. De specifieke taak van het eiwit bepaalt de ernst van de gevolgen.

Mutaties hebben veel verschillende oorzaken. Allereerst kan DNA beschadigd worden door normale scheikundige processen in de cel. Daarnaast wordt het DNA van buitenaf bedreigd, door bijvoorbeeld kosmische straling of chemische stoffen die met DNA reageren en genetische veranderingen veroorzaken. Schade veroorzaakt door straling kan bijvoorbeeld het gevolg zijn van een dagje strand (ultraviolette straling) of een bezoekje aan de tandarts (röntgenstraling). De chemische stoffen die DNA-schade veroorzaken, genotoxische agentia, kun je binnenkrijgen door het eten van gefrituurde kroketten of het inademen van tabaksrook. De hoeveelheid DNA-schades die we oplopen is enorm en wordt geschat op 10.000 gebeurtenissen per cel per dag. Om organismen te behoeden voor de mogelijk ernstige gevolgen van DNA-schade beschikt de cel over een heel scala aan noodgrepen. Er bestaan honderden eiwitten die betrokken zijn bij het opsporen, verwijderen en herstellen van DNA-schade. Gelukkig is reparatie in veruit de meeste gevallen succesvol. Wanneer de verdediging tegen DNA-schade dan toch faalt, kunnen beschadigde cellen zichzelf opofferen en afsterven (apoptosis). Soms echter ontwikkelen cellen zich tot kankercellen, die ongeremd groeien en tumoren veroorzaken. Het hele proces van schadeherstel wordt extra gecompliceerd, als je bedenkt dat de instructie voor het opbouwen van de DNA-schadehersteleiwitten ook gegeven wordt door genen in het DNA. Iedereen kan zich voorstellen dat als de genen beschadigd worden die coderen voor één van die hersteleiwitten, de gevolgen dramatisch zijn en leiden tot zeer complexe ziekteverschijnselen.

De integriteit van het DNA wordt het meest bedreigd, wanneer beide ketens van een DNA- molecuul doorbroken worden, een zogenaamde dubbel-strengs breuk (DSB). De veroorzakers van speciaal dit type DNA-schade, de DSB, zijn ioniserende straling (b.v. röntgenstraling en straling afkomstig uit radioactieve stoffen) en specifieke chemische stoffen. DSBs ontstaan ook spontaan tijdens de mitose en meiose. Bij zo¡¦n DSB kunnen de twee gebroken einden van een chromosoom uit elkaar drijven en de gevolgen daarvan kunnen natuurlijk rampzalig zijn. Herstel van deze DSBs is dan ook onontbeerlijk. De cel kan dubbel-strengs DNA-breuken op twee manieren repareren: 1. door de losse uiteinden simpelweg weer aan elkaar te plakken (DNA-eindverbinding ofwel non-homologous endjoining (NHEJ)). Dit proces is vanzelfsprekend niet altijd foutloos. 2. door de juiste informatie van een homoloog chromosoom (bijvoorbeeld het tweede chromosoom van een paar of een zuster-chromatide) te kopi&euml;ren (homologe recombinatie ofwel homologous recombination (HR)). Het homologe molecuul dient dan als matrijs voor foutloos DSB-herstel.

Dit proefschrift gaat vooral over de tweede manier van dubbel-strengs breukherstel via homologe recombinatie. Met het beschreven onderzoek hebben we geprobeerd te begrijpen wat de biologische gevolgen van bijvoorbeeld blootstelling aan straling zijn, onder andere omdat röntgenstraling veelvuldig wordt gebruikt als anti-kanker therapie. Daarnaast probeerden we met dit onderzoek inzicht te krijgen in hoe het herstel van DSBs moleculair in zijn werk gaat. Uiteindelijk probeerden we te begrijpen hoe homologe recombinatie bijdraagt aan het voorkomen van kanker. Voor ons onderzoek maakten we o.a. gebruik van modelorganismen als Schizosaccharomyces pombe (splijtgist) en muizen met een genetisch defect in één van hun DNA-reparatiemechanismen. Het gebruik van gisten als model voor menselijke cellen is niet zo ver gezocht als het lijkt. Ook al staan gisten en de mens evolutionair mijlenver uit elkaar, de genetische informatie is nog enigszins identiek. Dit blijkt uit het feit dat gistcellen die zich niet langer kunnen delen, gered kunnen worden door stukken menselijk DNA in de cel te spuiten.

In hoofdstuk 1, de inleiding, wordt uitgebreid verteld hoe dubbel-strengs breuken ontstaan, hoe we denken dat het herstel van DSBs via homologe recombinatie in zijn werk gaat en welke eiwitten daarbij betrokken zijn. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen het DSB-herstel tijdens de mitose en tijdens de meiose.

Met behulp van röntgengevoelige bakkersgistcellen zijn veel eiwitten ge&iuml;dentificeerd, die betrokken zijn bij het herstel van dubbel-strengs breuken in mitotisch delende cellen. Deze eiwitten behoren allemaal tot een familie van eiwitten betrokken bij stralingsgevoeligheid (radiation sensitivity), de RAD52-groep. Er zijn verschillende genen die coderen voor deze groep van eiwitten, onder andere het Rad51 gen, het Rad52 gen en het Rad54 gen. De functies van die eiwitten worden beschreven in paragraaf 1.3. In dit proefschrift houden wij ons vooral bezig met de functie van het Rad52 enzym. Rad52 is van vitaal belang voor bakkersgistcellen, maar zoogdiercellen waarin Rad52 ontbreekt, zijn normaal levensvatbaar. In splijtgist S. pombe zijn twee eiwitten gevonden die homoloog zijn aan bakkersgist Rad52, namelijk Rad22A en Rad22B. Een interessante vraag is of deze twee eiwitten, Rad22A en Rad22B, ook functioneel verschillend zijn. De resultaten van zo¡¦n onderzoek helpen om de functie van zoogdier Rad52 te begrijpen en kunnen ons op het idee brengen welk eiwit mogelijk de functie van Rad52 in zoogdieren heeft overgenomen. Recent is ontdekt dat de functies van bakkersgist Rad52 in zoogdieren waarschijnlijk worden uitgevoerd door het BRCA2 enzym. BRCA2 (breast cancer 2) is het eiwit dat ontbreekt of gemuteerd is bij mensen met een erfelijke vorm van borstkanker.

Om geslachtscellen te kunnen vormen, moet een bijzondere kerndeling, de meiose, ervoor zorgen dat er van elk paar chromosomen, slechts één enkel chromosoom in elke voortplantingscel komt. Hiervoor is het nodig dat de homologe chromosomen van één paar met elkaar verbonden worden in een ritssluitingachtige structuur, het synaptonemale complex (SC; zie figuur 3 van hoofdstuk 1). Deze structuur houdt de chomosomen van één paar bijeen tijdens de eerste fase van de meiose, maar belangrijker is, dat er nu binnen de hekwerken van het SC ook homologe recombinatie kan plaatsvinden tussen de gepaarde chromosomen. Deze homologe recombinatie tijdens de meiose zorgt voor nieuwe combinaties van genen, omdat genen worden uitgewisseld met genen op het homologe tweede chromosoom van een paar (een zogenaamde cross-over). Deze cross-overs zorgen voor herrangschikking van de eigenschappen, zodat er extra variatie onder nakomelingen ontstaat en liggen aan de basis van de evolutie.

Om genen uit te kunnen wisselen tussen homologe chromosomen worden er tijdens de meiose in de context van de vorming van het SC actief dubbel-strengs breuken gecre&euml;erd. Deze dubbel-strengs breuken worden vervolgens foutloos hersteld door homologe recombinatie. Er zijn verschillen tussen homologe recombinatie in de mitose en in de meiose. Ten eerste worden de DSBs in de meiose actief ge&iuml;nduceerd, ten tweede komt homologe recombinatie tijdens de meiose 100 tot 1000 keer vaker voor dan in mitotisch delende cellen en ten derde wordt tijdens de meiose bij voorkeur het homologe chromosoom gebruikt voor herstel, terwijl dit in normaal delende cellen ook een tweede kopie (chromatide) van het eigen chromosoom kan zijn. De eiwitten betrokken bij homologe recombinatie in mitose en meiose zijn veelal gelijk. In paragraaf 1.4 worden specifieke eiwitten betrokken bij homologe recombinatie tijdens de meiose verder besproken.

Tot slot wordt in hoofdstuk 1 aandacht besteed aan het reguleren van de functies van de verschillende eiwitten betrokken bij DSB-herstel. Om eiwitten te kunnen afbreken nadat zij hun functie hebben uitgevoerd of om eiwitten op de juiste plek in de cel te krijgen, worden eiwitten vaak gemarkeerd met een ander eiwit. Vooral het markeren met ubiquitine is bekend. De wetenschappers die ontdekten dat eiwitten die met ubiquitine gemarkeerd zijn, afgevoerd worden naar de afvalverwerking van de cel, noemden dit de kiss of death. Zij ontvingen een Nobelprijs voor hun werk. Behalve ubiquitine zijn er meer eiwitten die eiwitten kunnen markeren, zoals SUMO (small ubiquitin-like modifier). Hoe SUMO aan eiwitten wordt gekoppeld en wat er dan mogelijk met die eiwitten gebeurt, staat beschreven in paragraaf 1.5.

In hoofdstuk 2 concentreren we ons op de verschillen in functie tussen Rad22A en Rad22B in S. pombe. Om dit onderzoek uit te kunnen voeren hebben we eerst via gentechnologie bacteri&euml;n gemaakt, die we splijtgist Rad22A en Rad22B lieten produceren. Uit de bacteriecelextracten hebben we Rad22A en Rad22B gezuiverd. Met de gezuiverde Rad22A en Rad22B eiwitten hebben we proeven gedaan. We hebben ontdekt dat zowel Rad22A als Rad22B in staat zijn aan DNA te binden, maar dat Rad22A alleen bindt aan enkel-strengs DNA, terwijl Rad22B ook bindt aan DNA dat gedeeltelijk enkel- en gedeeltelijk dubbel-strengs is. Zowel Rad22A als Rad22B kunnen twee enkel-strengs DNA ketens aan elkaar plakken tot dubbel-strengs DNA (een proces dat annealing heet), maar Rad22A doet dat veel sneller en efficienter. De annealings-reactie van Rad22B wordt geremd wanneer teveel enkel-strengs DNA is omgezet en er dus teveel dubbel-strengs DNA is ontstaan. Als vervolgens Rad22A wordt toegevoegd aan de reactie, heft Rad22A de remming op en zorgt ervoor dat het enkel-strengs DNA dat nog in de reactie aanwezig is, wordt omgezet in dubbel-strengs DNA. Van de gezuiverde Rad22A en Rad22B eiwitten hebben we ook opnamen gemaakt met een electronenmicroscoop (zie de omslag van dit proefschrift). Uit deze opnamen blijkt dat zowel Rad22A als Rad22B hun functies niet uitvoeren als losse eiwitten, maar dat ze allebei grotere complexen vormen, waarbij een aantal (waarschijnlijk zeven) Rad22A of Rad22B eiwitten aan elkaar vastzitten.

In hoofdstuk 3 wordt duidelijk hoe Rad52 samenwerkt met Rad54, een ander eiwit van de Rad52 groep. We hebben deze samenwerking onderzocht, door splijtgistcellen te maken waarin we Rad22A, Rad22B en Rhp54 (Rad54 homoloog pombe) in verschillende combinaties uitschakelden. We onderzochten de enkel, dubbel of trippel mutante splijtgistcellen op röntgengevoeligheid en gevoeligheid voor de chemische stoffen cis-platinum en hydroxyurea. Het blijkt dat de functies van Rad22A, Rad22B en Rhp54 bij het herstel van DSB zo verweven zijn, dat wanneer één van deze eiwitten uitgeschakeld is, het dubbel-strengs breukherstel via homologe recombinatie niet meer goed kan verlopen.

We hebben de onderlinge betrokkenheid van Rad52 en Rad54 ook onderzocht in muizen. In muizen waarin we zowel Rad52 als Rad54 uitschakelden, blijkt dat meestal de defecten veroorzaakt door de afwezigheid van Rad54 niet worden versterkt door afwezigheid van Rad52. In twee specifieke situaties leidde de aangebrachte schade echter wel tot versterkte defecten, namelijk in het geval dat we röntgenschade aanbrachten aan beenmergcellen van de muis en in het geval dat we hele muizen inspoten met de chemische stof MMC. We concludeerden hieruit dat wanneer Rad52 en Rad54 afwezig zijn, behalve de homologe recombinatie ook bijvoorbeeld de annealing van enkel-strengs DNA (een rol van Rad52) niet meer goed verloopt.

In hoofdstuk 4 beschrijven we dat eiwitten betrokken bij dubbel-strengs breukherstel gemarkeerd worden door SUMO. We ontdekten dat Rad22A en Rad22B in splijtgist S. pombe waarschijnlijk gemodificeerd worden door SUMO, doordat beide eiwitten interacteren met Hus5, een enzym dat SUMO koppelt aan haar doelwit. We vonden dezelfde interacties bij homologe eiwitten in Drosophila melanogaster, de fruitvlieg. We onderzochten het effect van afwezigheid van Su(Var)2-10, een enzym dat SUMO bij een specifiek doelwit in de buurt brengt, op de levensvatbaarheid van fruitvliegen na bestraling. We vonden dat als er onvoldoende Su(Var)2-10 aanwezig is, fruitvliegen een verlaagde overlevingskans hebben na blootstelling aan röntgenstraling. We zochten ook naar een homoloog van Su(Var)2-10 in S. pombe en vonden een stuk S. pombe DNA dat informatie bevat voor een eiwit dat homoloog is aan Su(Var)2-10 en soortgelijke enzymen in andere organismen die SUMO aan een specifiek doelwit koppelen. We noemden dit vermoedelijke enzym Pli1 en hebben het gen dat codeert voor Pli1 uitgeschakeld in splijtgistcellen. Afwezigheid van Pli1 leidde niet tot verhoogde röntgengevoeligheid in splijtgist. We vermoeden dat, ondanks dat er duidelijke aanwijzingen zijn dat eiwitten betrokken bij homologe recombinatie gemodificeerd worden met SUMO, deze modificatie slechts indirect betrokken is bij DSB-herstel. We denken dat zonder SUMO modificatie de structuur van de celkern niet langer intact kan worden gehouden, met bijbehorende effecten op bijvoorbeeld DNA herstelprocessen.

In hoofdstuk 5 geven we het belang aan van een goed functionerend synaptonemaal complex (SC) tijdens de meiose. De ritssluitingstructuur van het SC bestaat uit twee axiale ketens die parallel aan de homologe chromosomen liggen en transversale elementen die de homologe chromosomen met elkaar verbinden. Wanneer we in muizen het gen uitschakelen dat codeert voor één van de transversale eiwitten, Sycp1, wordt het SC niet goed opgebouwd. De muizen zijn dan onvruchtbaar. Uit verder onderzoek van de meiose in deze muizen blijkt, dat de eerste stappen van de meiose, waarin de paring van de homologe chromosomen en de homologe recombinatie plaatsvinden, wel ingezet worden, maar dat de meiose niet wordt afgemaakt. Daadwerkelijke uitwisselingen van genen tussen de homologe chromosomen (cross-overs) vinden niet plaats. We denken daarom dat Sycp1 een coördinerende rol speelt tijdens de meiose en cross-overs mogelijk maakt.

Over tsjok45
Gepensioneerd . Improviserend jazzmuzikant . Instant composer. Jamsession fanaat Gentenaar in hart en nieren

2 Responses to GENETISCHE REPARATIES –>DNA schade herstel

  1. Pingback: INHOUD G | Tsjok's blog

  2. Pingback: VERKLARENDE WOORDENLIJST PALEONTOLOGIE E | Tsjok's blog

Geef een reactie

Vul je gegevens in of klik op een icoon om in te loggen.

WordPress.com logo

Je reageert onder je WordPress.com account. Log uit / Bijwerken )

Twitter-afbeelding

Je reageert onder je Twitter account. Log uit / Bijwerken )

Facebook foto

Je reageert onder je Facebook account. Log uit / Bijwerken )

Google+ photo

Je reageert onder je Google+ account. Log uit / Bijwerken )

Verbinden met %s

%d bloggers op de volgende wijze: